Cellules animales
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Description générale de la culture des cellules animales
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Cellules animales
- 1. La culture de cellules animales, quosse ça donne? Alain Garnier, Université Laval
- 2. Plan • La culture de cellules animales: – Qu’est-ce? – Pourquoi? – Comment?
- 3. Qu’est-ce? • Différentes sources • Différents types • techniques de transformation • Caractéristiques générales
- 4. Sources • Insectes • Poissons • Mammifères • Humains
- 5. Formes/tissus • Épithéliales/endothéliales (membranes) • Fibroblastes (tissus connectifs) • Myoblastes (muscles) • Neurones (syst. nerveux) • Hepatocytes (foie) • Erythrocytes (sang) • Lymphocytes (syst. immunitaire)
- 6. Formes...
- 7. Types • Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC). • Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions). • Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.
- 8. Transformations • Naturelles • Chimiques • Virales • Dirigées
- 9. Différentes lignées • MRC5, W138: secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins • HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche • CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile • Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile • Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression baculovirus • 293: embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S)
- 10. Exemple: l’historique de la mise en culture des 293 Graham, et al., J. Gen. Virol., 36:59-72, 1977
- 11. Caractéristiques générales • Capable d’exocytose • Ne sécrète pas d’enzymes • Modifications post-traductionnelles • Introns/épissage (splicing) • Besoins nutritionnels complexes • Grande taille (10-20 µm), pas de paroi • Sensible au contraintes hydrodynamiques • Temps de division lent (approx. 1 jour) • Densité cellulaire faible
- 12. Modification post-traductionnelle • Clivage • Pont S • méthylation, phosphorylation, glycosylation • conformation • ajout de ligands spécifiques (lipid anchor)
- 13. Glycosylation
- 15. Pourquoi? • Pour l’étude • Pour la production: – Vaccins – Protéines thérapeutiques • anticorps • agents immunologiques • Hormones – Tissus – Vecteurs viraux – Cellules souches
- 16. 34% des nouveaux médicaments sont produits en culture de cellules de mammifères 34% 21% 22% 12% 12% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% % Cell. Mam. Microbe Vaccins Extr/Synthèse Thérapie génique % de médicaments approuvés ou en essais cliniques en 2000 (Odum, Pharma. Eng., 2001)
- 17. Les anticorps Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour réagir avec un antigène donné. Ce sont des molécules de 150kDa, composées de 2 paires de polypeptides, l’une de 25kD (chaîne courte, domaine variable), l’autre de 50 kDa (chaîne longue, domaine constant). La chaîne courte est responsable de la spécificité de l’anticorps pour son antigène
- 19. Anticorps monoclonaux - applications • 37% des nouvelles molécules thérapeutiques biologiques • Identification/diagnostic • Thérapeutique: – Contre cancer, Crohn, Asthme, SIDA, etc. – Dirigés contre une protéine spécifique, ils peuvent bloquer une interaction récepteur-ligand ou déclencher une réponse immunitaire. – Ils peuvent aussi être liés à un agent chemothérapeutique, radioactif ou autre pour augmenter leur effet.
- 20. Autres protéines • Erythropoïétine (EPO, traitement de l’anémie) • Hormones de croissance: – Transforming Growth Factor (TGF) – Epidermal Growth Factor (EGF) – Nerve Growth Factor (NGF) • Anovulants • Cytokines (Interleukine, interféron, etc) • Agents coagulants (Facteur viii), anti- coagulants, etc
- 21. Interleukin 4
- 22. Exemple: Agent anti-angiogénétique (Laboratoires Aeterna) Le processus de l’angiogénèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux, joue un rôle important dans le développement de la tumeur cancéreuse. Certains agents peuvent inhiber ce processus. Les agents isolés par Aeterna proviennent de l’aileron de requin. La prochaine étape consiste à isoler les gènes responsables de la synthèse de ces agents et de les cloner dans des cellules animales.
- 23. Influenza Herpes Adenovirus Production de vaccins
- 24. Thérapie génique
- 26. Vecteurs utilisés Adénovirus Rétrovirus La thérapie génique consiste à traiter une maladie par le transfert de matériel génétique. Les virus sont particulièrement bien adaptés pour accomplir cette tâche.
- 27. Culture de tissus • Cellules de peau (Hopital du Saint- Sacrement, Laboratoire d'organogénèse expérimentale) • Reconstruction de la moëlle épinière (Organogel inc.) • Organes (foie, cœur, cerveau, etc) • Cellules souches
- 28. Comment? Caractéristiques générales – Capable d’exocytose – Ne sécrète pas d’enzymes – Modifications post-traductionnelles – Introns/épissage (splicing) – Besoins nutritionnels complexes – Grande taille (10-20 µm), pas de paroi – Sensible au contraintes hydrodynamiques – Temps de division lent (approx. 1 jour) – Densité cellulaire faible
- 29. Exemple de milieu de culture: Dulbecco Modified Eagle medium (DMEM) • Sels (mg/L) – CaCl2 200.00 – Fe(NO3)3.9H2O 0.10 – KCl 400.00 – MgSO4 97.67 – NaCl 6400.00 – NaHCO3 3700.00 – NaH2PO4.H2O 125.00 • Acides aminés (mg/L) – Arginine 84.00 – Cystine.2HCl 63.00 – Glutamine 584.00 – Glycine 30.00 – Histidine 42.00 – Isoleucine 105.00 – Leucine 105.00 – Lysine.HCl 146.00 – Méthionine 30.00 – Phenylalanine 66.00 – Sérine 42.00 • + mélange d'additifs non-définis – Méthionine 30.00 – Phenylalanine 66.00 – Serine 42.00 – Thréonine 95.00 – Tryptophane 16.00 – Tyrosine.2Na.2H2O 104.00 – Valine 94.00 • Vitamines (mg/L) – Ca.pantothénate 4.00 – Chlorure de choline 4.00 – Acide folique 4.00 – Inositol 7.20 – Niacinamide 4.00 – Riboflavine 0.40 – Thiamine.HCl 4.00 – Pyridoxine.HCl 4.00 • Autres (mg/L) – Glucose 4500.00 – Rouge de phénol 15.00 – Na.Pyruvate 110.00
- 30. Sensibilité aux contraintes hydrodynamiques = problème d’oxygénation ou d’agitation •Pourtant les besoins en O2 des cellules animales ne sont pas si élevés X (densité cellulaire) QO2 (taux de respiration spécifique) Oxygen respiration rate (OUR, mM/L) Bactéries 5-50 gMS/L 0.01 mole/(gMS.h) 50-500 Cellules animales 1-50 E6 cells/mL 10-20 E-14 mole/(cell.h) 0.1-10
- 31. Les cellules animales ne supportent que de très petites contraintes hydrodynamiques, ce qui fait en sorte que toutes sorte d’indice de sévérité de l’agitation on été proposés: ISF D D D i T i = • − Ω D PE s= ( / ) / ν3 1 4 U PE s= •( ) / ν 1 4 Integrated Shear Factor (Sinskey) Taille du plus petit tourbillon (Théorie de Kolmogoroff) Vitesse du plus petit tourbillon TCS: Turbulent collision severity (Cherry et Papoutsakis) ICS: Impeller collision severity C K PE s= •( ) / ν 3 3 4 Concentration en plus petit tourbillon
- 32. Plusieurs géométries de bioréacteurs ont été proposées: • différentes formes d’agitateur – marine – ruban hélicoïdal – «voiles» • gazosyphon • lits fluidisés • transfert de gaz par tube de silicone • enrichissement en oxygène
- 33. Agitateur «voiles» Lit fluidisé
- 34. Division lente, faible densité • Facilement contaminable – une bactérie prendra facilement le dessus – Nécessite des conditions d'asepsie très strictes • Faible rendement en produit – produit à haute valeur ajoutée – produit qui ne peut être synthétisé dans d’autres systèmes d ’expression – Recherche de moyens pour augmenter la densité cellulaire...
- 35. Au niveau cellulaire: le mécanisme de débordement -Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma) GLUCOSE PYRUVATE TCA cycle, resp. chain lactate glucose pyruvate GLUTAMINE GLUTAMATE OU glutamine NH3 NH3 glutamate
- 36. Au niveau du procédé • L’optimisation du milieu prend du temps, mais permet de faire de grandes économies • La cuvée alimentée peut permettre d’augmenter la densité cellulaire dans le cas d’un substrat inhibiteur ou d’un produit inhibiteur dont la production dépend de la concentration en substrat. • Le chemostat ou la perfusion vont permettre une augmentation de la densité cellulaire et de la productivité, mais avec un coût plus élevé en milieu de culture
- 37. Au niveau du bioréacteur – Microporteurs (poreux ou non) – Micro-capsules – Fibres creuses – Rétention des cellules (perfusion): • Spin-filters (intra ou extra bioréacteur) • centrifugeuse en continu • Sonosep
- 38. Microporteurs
- 39. Exemple: Un filtre rotatif intra- bioréacteur, combiné à un aérateur
- 40. Fibres creuses
- 43. Conclusion • La culture de cellules animales est coûteuse et complexe. • Elle ne doit être utilisée que pour produire des molécules qui ne peuvent être obtenues autrement. • Elle permet alors de synthétiser des produits à très haute valeur ajoutée
Notes de l'éditeur
- Lymphocytes activés + myelomes + clonage = hybridomes
- November 8, 1999 Contact: Malika Rajan Telephone: (203) 853-4266 Fax: (203) 853-0348 Email: publisher@buscom.com Additional Press Releases: http://buscom.com/editors/pressreleases.html THE AGE OF THE ANTIBODY HAS COMMENCED Antibody-based drugs, in particular monoclonal antibody-based products, are on the cusp of significant commercial growth. New developments are spurred in part by advances in technology that have now surmounted previous technical barriers to commercialization. According to a soon-to-be-released BUSINESS COMMUNICATIONS CO., INC., study RC-088U Antibody for Therapeutic and Diagnostic Imaging Applications, the total worldwide market is estimated at nearly $2.8 billion in 1999, and is forecast to grow to almost $9.8 billion in 2004. With the rollout of dozens of new antibody products and expanded indications for existing products expected during the forecast period, the AAGR (average annual growth rate) for this sector as a whole is projected at 21.8%. As of August 1999, there were 17 therapeutic and diagnostic monoclonal antibody products on the U.S. market. Worldwide, there were more than 700 monoclonal antibody products in development by more than 260 companies for the treatment of virtually every debilitating disease. Approximately 220 of these monoclonal antibody products were in clinical trials. According to the Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA), monoclonal antibody products represented approximately 37% of all biotechnology products in development by its members. Therapeutic applications represent over 99% of the market, and will grow at an average annual rate of 21.6% through the period, thereby growing from $3.6 million in 1999 to $9.7 million in 2004. Still in its inception stage in the late 90s, diagnostic-imaging applications will grow at a fast AAGR of nearly 50% to reach $196 million by 2004. This report analyzes and assesses therapeutic and in vivo diagnostic imaging applications of antibodies in human medicine. The document is intended to be comprehensive with respect to products as well as applications. The scope of the study is worldwide and provides a comprehensive analysis of the current markets for antibody drugs and, in particular, the market potential of promising drugs and technologies under development. Included are both polyclonal and monoclonal antibodies. Excluded are therapeutic and diagnostic imaging antibodies for veterinary use. Also excluded are in vitro immunoassay applications of antibodies. http://www.bccresearch.com/editors/RC-088U.html